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穩(wěn)定細胞系構(gòu)建的原理步驟解析

更新時間:2017-10-17      點擊次數(shù):5914
   穩(wěn)定細胞系構(gòu)建的原理步驟解析
  本文主要解析了穩(wěn)定細胞系構(gòu)建的原理和穩(wěn)定細胞系建立的流程,及瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細胞系構(gòu)建的區(qū)別與。幫助我們選擇合適的細胞轉(zhuǎn)染的方法,瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞
  真核蛋白表達的方式有兩種:瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(穩(wěn)定細胞系構(gòu)建)。根據(jù)自身真核蛋白表達的目的選擇合適的轉(zhuǎn)染方法非常重要。瞬時轉(zhuǎn)染持續(xù)時間較短,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞,3-4天就會丟失。因此可以得到少量的蛋白。相對于此,穩(wěn)定抵不住篩選是一個長期的過程,需要足夠的耐心和細心。
  穩(wěn)定細胞系構(gòu)建原理
  真核蛋白表達穩(wěn)定細胞系建立的原理是,將我們所要的目的基因真核到宿主細胞上,隨著細胞的生長繁殖,目的基因可以穩(wěn)定的表達,在通過抗生素的不斷加壓篩選,zui終得到構(gòu)建穩(wěn)定細胞系的過程。相對于瞬時轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)持續(xù)周期長,細胞整合穩(wěn)定,能夠滿足后期對蛋白的大量需求。
  穩(wěn)定細胞系構(gòu)建  實驗流程
  1.細胞培養(yǎng)
  細胞培養(yǎng)是真核蛋白蛋白實驗中的*步,原核利用大腸桿菌,真核蛋白表達是培養(yǎng)哺乳動物細胞,常用的真核蛋白表達細胞有CHO,HEK293細胞,穩(wěn)定細胞系建立選擇CHO細胞。
  細胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快復(fù),防止在解凍過程中,產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復(fù)蘇一般步驟如下:
  1)預(yù)先加熱水浴鍋,溫度至37-40℃,并在離心管中準備好10ml培養(yǎng)基
  2)從液氮罐或冰箱中取出細胞,迅速放進預(yù)熱的水浴鍋中,鑷子夾住凍存管晃動,使其受熱均勻
  3)當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時,注意用酒精擦拭凍存管消毒,將液體倒入含有10ml培養(yǎng)基的離心管中
  4)離心5min,去除上清,得到沉淀
  5)用培養(yǎng)基懸浮沉淀,并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)
  細胞復(fù)蘇后,生長一段時間,95%的細胞貼壁生長,細胞狀態(tài)良好,說明細胞復(fù)蘇成功。
  2.穩(wěn)定細胞系構(gòu)建(一)
  以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑為例進行先瞬時轉(zhuǎn)染,不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書
  1)將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細胞按照1-3x10^5接種到6孔板中,加入2-4ml的*培養(yǎng)基,混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜
  2)無菌狀態(tài)下配置如下溶液:a 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒
  b 用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑(血清的存在會影響轉(zhuǎn)染效率,因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染)
  3)將ab溶液混合并搖勻,室溫下放置30min左右
  4)細胞培養(yǎng)至80%單層左右,用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次,每孔加入1ml的無血清培養(yǎng)基,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時
  5)將轉(zhuǎn)染液倒出,換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
  3.穩(wěn)定細胞系建立
  24-72h加入選擇性抗生素進行穩(wěn)定細胞株篩選,預(yù)實驗確定抗生素的*濃度,確定抗生素對所選細胞的zui低作用濃度。1)提前一天接種細胞與24孔板中,待第二天長成25%單層為宜,二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。
  2)第二天將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml)。
  3)培養(yǎng)15天左右絕大多數(shù)細胞死亡抗生素濃度為準,一般為400-800ug/ml,篩選細胞時可適當(dāng)提高濃度
  4)二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h后按照1:10的比例將轉(zhuǎn)染細胞傳代,使用預(yù)實驗得到的抗生素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)。后挑選單克隆,有限稀釋法挑取單克隆。有限稀釋法:將細胞消化下來做連續(xù)的10倍稀釋,每稀釋一梯度都在9孔板中培養(yǎng),生長一周左右再次挑取單克隆進行培養(yǎng),如此反復(fù)3次。
  5)Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況,挑取多個單克隆進行表達檢測,篩選出表達量zui高的克隆傳代保存。
  zui終篩選出穩(wěn)定高表達目的基因的細胞株,相對于瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細胞系構(gòu)建在后續(xù)可以節(jié)約大量的時間和成本,是滿足活性蛋白大量制備的方法。
  真核系統(tǒng)蛋白表達的操作較為繁瑣,困難,有一定的操作難點,相對原核表達得到的蛋白更具天然活性,同酵母表達相似,可以實現(xiàn)蛋白的各種修飾,只是真核蛋白表達可以實現(xiàn)蛋白的復(fù)雜、修飾。在制藥,活性因子生產(chǎn)方面有很大應(yīng)用。
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