傳代細胞的傳代方法及操作過程

實驗原理
    傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。
    這種培養(yǎng)，*步也是制備細胞懸液，當細胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸鹽）的混合物，做為消化液。
    細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。
主要試劑
L磷酸鹽緩沖液（PBS）
無鈣、鎂溶液
細胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
0.5％臺盤藍染液等
主要設備
    解剖剪、解剖鑷、眼科剪（尖頭、彎頭）、眼科鑷（尖頭、彎頭）、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須*清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa（15磅）滅菌30min備用。
    此外，還有顯微鏡、血細胞計數(shù)器、血細胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標記筆、解剖板等。
實驗材料
喉癌細胞
實驗步驟
在做傳代細胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。
1. 營養(yǎng)液配制:
EMEM液                                90%
犢牛血清                                10%
雙抗（1萬單位／m1）                加至約100單位／m1
3％谷氛酞胺                           1m1
7.4％NaHCO3                         調(diào)pH至6.8—7.0
2. 換液:
在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細胞營養(yǎng)液。
3. 消化與分裝
    在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層是否出現(xiàn)縫隙（針孔大小的空隙），如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復吹打瓶壁上的細胞層至瓶壁細胞全部脫落下來為止。此時，可繼續(xù)輕輕地吹打細胞懸液，以使細胞散開。隨之進行分裝。
4. 培養(yǎng)
    分裝好的細胞瓶上，做好標志，注明細胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細胞均勻分布，以免堆積成團。然后置于37℃培養(yǎng)。
5. 觀察
   1） 觀察體外培養(yǎng)細胞的幾個問題；
細胞培養(yǎng)24h后，即可進行觀察，觀察的重點如下：
      a. 首先要觀察培養(yǎng)細胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度
      b. 觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細胞是否生長。
      c. 如細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照2）的描述進行。
      d. 觀察完畢，可用臺盤藍染液對細胞進行染色。以確定死、活細胞的比例。
   2） 細胞的生長階段及其形態(tài)特征
傳代培養(yǎng)的細胞需逐日進行觀察，注意細胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細胞生長的情況。—般中層培養(yǎng)的細胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個時期，但各期間無明顯界限。現(xiàn)分別描述如下：
      a. 游離期：當細胞經(jīng)消化分散成單個細胞后，由于細胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細胞膜的彈性。所以，此時細胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。
      b. 吸附期（貼壁）：由于細胞的附壁持性，細胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間（約7—8h）后，便附著在瓶壁上（此期不同細胞所需時間不同）。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細胞，如圓形、扁形、短菱形。細胞的特點，大多立體感強，細胞內(nèi)顆粒少，透明。
      c. 繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細胞進入繁殖期，加速了細胞生長和分裂。此期包括由幾個細胞形成的細胞島（即由少數(shù)細胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細胞群，常散在地分布在瓶壁上），到細胞鋪滿整個瓶壁（即所謂形成細胞單層）的過程。此期細胞形態(tài)為多角形（呈現(xiàn)上皮樣細胞的特征）。細胞特點：透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。根據(jù)細胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下：
十：細胞占瓶壁有效面積（也就是細胞能生長的瓶壁面積）的25％以內(nèi)有新生細胞。一般要觀察3—5個視野內(nèi)的細胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。
十十：細胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細胞。
十十十：細胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細胞。細胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十：細胞占瓶壁95％以上，細胞已長滿或接近長滿單層，細胞致密，透明度好。
從十十一十十十十為細胞的對數(shù)增長期（或稱為指數(shù)增長期）。
      d. 維持期：當細胞形成良好單層后，細胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細胞生長的接觸抑制。此時細胞界限逐漸模糊，細胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。
      e. 衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時細胞間可出現(xiàn)空隙，細胞中顆粒進一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細胞經(jīng)固定染色處理后，可見細胞中有大而多的脂肪滴及液泡。zui后，細胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。