ATCC細胞株建株的要點及基本過程

　　（一）腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)要點

　　1、取材：材料主要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。

　　2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中?；祀s有一些成纖維細胞，培養(yǎng)時能與瘤細胞同時生長，并常壓過癌細胞，導(dǎo)致癌細胞生長受阻以至消失，應(yīng)仔細排除。

　　排除方法常有：機械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

　　3、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率

　　根據(jù)實驗經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養(yǎng)后，要經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據(jù)細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。

　?。ǘ┤祟惲馨湍讣毎?strong>ATCC細胞株方法

　　l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。

　　2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml淋巴細胞分離液的液面上靜置30min。

　　3、1500rpm，15min，吸取白細胞層（第二層）于另一離心管中。

　　4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。

　　5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EB（EB病毒）液，混勻。

　　6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。

　　7、1500rpm，15min。將細胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37℃培養(yǎng)。

　　8、5天后觀察細胞轉(zhuǎn)化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l-2次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。

　　9、待轉(zhuǎn)化細胞數(shù)量明顯上升，并出現(xiàn)細胞團塊后，可轉(zhuǎn)入25ml細胞培養(yǎng)瓶中，加1-2ml培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10-15天，一般每隔3-4天觀察一次，決定是否換液，傳代。

　　10、細胞生長達一定數(shù)量后凍存，凍存前應(yīng)進行核型分析和存檔。

　　建立什么樣的體外培養(yǎng)ATCC細胞株可被認可為己鑒定的細胞？視具體情況而定，無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長期培養(yǎng)，特別是反復(fù)傳代的細胞，常需說明組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；個體性別、年齡；取材的器官或組織。如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。細胞生物學(xué)檢測，了解細胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細胞一般形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細胞生長曲線和分裂指數(shù)，倍增時間，接種率等。如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。培養(yǎng)條件和方法，應(yīng)說明ATCC細胞株適應(yīng)的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。